1、原理簡介  

      ATAC-seq技術(shù)由ATAC實(shí)驗(yàn)和高通量測(cè)序兩部分組成，它是分子生物學(xué)研究染色質(zhì)可接近性的技術(shù)。該技術(shù)在2013年首次被提出，作為MNase-seq、FAIRE-seq和DNAse-seq的替代或補(bǔ)充方法。ATAC-seq實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵部分是轉(zhuǎn)座酶Tn5對(duì)樣品基因組DNA的作用。

    ATAC-seq采用突變的多活性轉(zhuǎn)座酶，允許高效切割暴露的DNA和同時(shí)連接特定序列的接頭。分離接頭連接的DNA片段，通過PCR擴(kuò)增后用于高通量測(cè)序。

ATAC(Assay for Transposase-Accessible Chromatin)

　　攜帶著接頭（Adapter）的轉(zhuǎn)座酶復(fù)合物進(jìn)入到染色質(zhì)開放區(qū)域，將處于松散狀態(tài)的DNA片段化同時(shí)末端加上接頭。特定成對(duì)的PCR引物在DNA片段擴(kuò)增同時(shí)末端加上index，經(jīng)分選純化后即為可測(cè)序文庫。

2、技術(shù)目標(biāo)

       ATAC-seq技術(shù)檢測(cè)染色質(zhì)開放區(qū)域，即Tn5酶可接近的DNA區(qū)域，將快速又敏感的表觀遺傳現(xiàn)象可視化。使用具有50,000個(gè)細(xì)胞的簡單兩步方案捕獲開放的染色質(zhì)位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座子優(yōu)先并入一般沒有核小體（無核小體區(qū)域）或暴露DNA段的基因組區(qū)域。因此，基因組中某些基因座序列的富集表明該區(qū)域不存在核小體，處于DNA結(jié)合蛋白等核機(jī)器能進(jìn)入的松散暴露狀態(tài)，提供有關(guān)染色質(zhì)區(qū)段轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)的信息。

       ATAC-seq實(shí)驗(yàn)的測(cè)序部分通常將產(chǎn)生數(shù)百萬個(gè)可以成功比對(duì)到參考基因組的高通量測(cè)序reads。每條reads指向在實(shí)驗(yàn)期間發(fā)生的一次切割事件在基因組上的位置。然后對(duì)比對(duì)到參考基因組上的reads進(jìn)行計(jì)數(shù)，并創(chuàng)建具有堿基對(duì)分辨率的信號(hào)峰值（peak）。

　　在實(shí)驗(yàn)過程中DNA可接近的基因組區(qū)域（染色質(zhì)開放區(qū)域）含有更多的測(cè)序reads（因?yàn)檗D(zhuǎn)座酶優(yōu)先作用于這些位置）。這些開放位點(diǎn)區(qū)域可以進(jìn)一步分為各種調(diào)節(jié)元件類型：啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，絕緣子等。通過進(jìn)一步的信息整合，如峰與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離，產(chǎn)生處于開放區(qū)域作用下的基因列表；或計(jì)算開放區(qū)域內(nèi)的高傾向結(jié)合某種特定蛋白的堿基序列（motif），得到活躍基因的上游調(diào)控因子，提供全基因組轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生的信息。

       ATAC-seq技術(shù)可以進(jìn)行樣本之間差異的染色質(zhì)開放位點(diǎn)的比較，通常并不單獨(dú)使用。作為檢測(cè)表觀遺傳-染色質(zhì)開放狀態(tài)現(xiàn)象的方式，與樣本基因表達(dá)譜緊密相連，從靶標(biāo)基因的表觀狀態(tài)關(guān)聯(lián)到表達(dá)水平，具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)挖掘作用。此外，通過關(guān)聯(lián)基因組、外顯子，染色質(zhì)免疫共沉淀（組蛋白修飾或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合）測(cè)序信息，形成：表觀調(diào)控-基因組-基因表達(dá)的完整調(diào)控鏈。

3、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

　　采用轉(zhuǎn)座酶法進(jìn)行DNA片段化，將繁瑣的DNA片段化、末端修復(fù)和接頭連接反應(yīng)等步驟變?yōu)橐徊胶唵蔚拿复俜磻?yīng)，將實(shí)驗(yàn)耗時(shí)縮減到2-3小時(shí)。

　　實(shí)驗(yàn)步驟簡化帶來的備樣時(shí)間跨度縮短和失誤概率降低，使實(shí)驗(yàn)成功率和可重復(fù)性大大提升。

　　樣本需求量從***別甚至***別降低到為50,000個(gè)細(xì)胞，相較于被替代技術(shù)，樣本量縮減了至少1000倍，當(dāng)樣本收集困難時(shí)更顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

4、參考文獻(xiàn)

1.Wu JY. et al. (2016) The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature.534(7609): 652-657.

2.Greenleaf WJ.et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNDNA-binding proteins and nucleosome position . Nat Methods. 2013 Dec.

文庫構(gòu)建策略

文庫大小范圍為170-750bp。

測(cè)序策略

采用Hiseq X10 PE150 測(cè)序。

實(shí)驗(yàn)流程

1) 細(xì)胞計(jì)數(shù)

2) 細(xì)胞裂解，轉(zhuǎn)座反應(yīng)和純化

3) PCR 反應(yīng)和純化

4) 片段選擇

5）文庫檢測(cè)

6) 上機(jī)測(cè)序

項(xiàng)目周期

8-24 個(gè)樣品標(biāo)準(zhǔn)流程的運(yùn)轉(zhuǎn)周期約為40 個(gè)工作日，此周期未包括物料訂購周期，定制化產(chǎn)品未備庫物流，需提前與交付溝通物料申購。遇樣品數(shù)較多或較少時(shí)，項(xiàng)目周期根據(jù)項(xiàng)目規(guī)模評(píng)估而定。

樣本要求

樣本需求量：每個(gè)樣本細(xì)胞總數(shù)200,000 個(gè)，稀釋于細(xì)胞凍存液，分裝于凍存管，每管細(xì)胞嚴(yán)格控制在50,000 個(gè)，總體積不低于1ml。

* 建議所送樣本細(xì)胞活性高，為生長狀態(tài)良好的新鮮組織或細(xì)胞。

* 一次反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)對(duì)于ATAC-seq 實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，請(qǐng)務(wù)必做好細(xì)胞計(jì)數(shù)工作。

細(xì)胞樣本處理方法

1、收集活性高，生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液；

2、用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為50,000 個(gè)/ml；

3、轉(zhuǎn)移體積1mL 的細(xì)胞懸浮液至凍存管中；

4、把凍存管放到程序降溫盒內(nèi)，再把程序降溫盒放到-80℃的冰箱里，盒內(nèi)溫度會(huì)成線性下降。保護(hù)細(xì)胞不被損傷；

5、-80℃降溫6-24h后，即可準(zhǔn)備樣本運(yùn)輸。

樣本標(biāo)識(shí)

在容器表面寫清樣品名稱，且與信息單上一致。不建議用油性筆直接在管壁或管蓋上寫樣品名稱等信息，**將樣品名稱等各種信息寫在標(biāo)簽紙上，貼在管壁，外面再用透明膠帶纏繞一圈(防止標(biāo)簽紙沒有粘牢脫落，導(dǎo)致樣品無法應(yīng)用)。

樣本運(yùn)輸

運(yùn)輸過程中需要添加的干冰和冰袋的量與季節(jié)、運(yùn)輸時(shí)間長短、泡沫盒的薄厚有關(guān)(為更有利于保溫，盡量選用大塊的干冰，建議將樣品用透明膠固定于冰袋上，防止干冰揮發(fā)導(dǎo)致樣品降解)。所有樣品盡量保證48 小時(shí)內(nèi)運(yùn)達(dá)。

備注: ATAC-seq 建庫一般細(xì)胞起始數(shù)量范圍為:50,000 個(gè)細(xì)胞，具體起始量與細(xì)胞活性及細(xì)胞類型相關(guān)，細(xì)胞數(shù)量足夠的樣本，成功率更高。

細(xì)胞活性檢測(cè)方法參考

臺(tái)盼藍(lán)染色法

1、4%臺(tái)酚藍(lán)母液使用時(shí)用PBS 稀釋至0.4%，并用0.2um 的濾膜進(jìn)行過濾處理；

2、細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)酚藍(lán)溶液以9:1 混合混勻。（終濃度0.04%），在三分鐘內(nèi)，

分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。

3、細(xì)胞活性在70%以上較為理想。若細(xì)胞活性率太低，建議進(jìn)行活細(xì)胞篩選。

一、背景介紹

二、實(shí)驗(yàn)測(cè)序流程

1、實(shí)驗(yàn)步驟

2、上機(jī)測(cè)序

三、生物信息分析流程

四、結(jié)果展示及說明

1、原始序列數(shù)據(jù)

2、測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

2.1測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查

2.2堿基含量分布檢查

2.3ADAPTER CONTENT分析

2.4測(cè)序數(shù)據(jù)過濾

3、ATAC-SEQ數(shù)據(jù)分析結(jié)果展示

3.1項(xiàng)目小結(jié)

3.2主要結(jié)果展示

3.3ATAC-SEQ數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分析結(jié)果詳解

3.3.1ATAC-SEQ數(shù)據(jù)參考序列比對(duì)（READS MAPPING）結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.3.2結(jié)合位點(diǎn)檢測(cè)（PEAK CALLING）質(zhì)量控制

3.3.3PEAKS在全基因組功能性區(qū)域上的分布注釋

3.3.4回帖序列（MAPPED READS）在基因附近的分布特征分析

3.3.5ATAC-SEQ READS在基因上的分布HEATMAP

3.3.6結(jié)合位點(diǎn)（PEAK）進(jìn)化保守性分析

3.3.7MOTIF分析

3.3.8結(jié)合位點(diǎn)關(guān)聯(lián)基因篩選

3.3.9結(jié)合位點(diǎn)靶基因GO功能富集分析

3.3.10結(jié)合位點(diǎn)靶基因KEGG PATHWAY富集分析

3.4不同組ATAC-SEQ數(shù)據(jù)差異分析結(jié)果

3.4.1差異結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別

3.4.2差異結(jié)合位點(diǎn)的MOTIF分析

3.4.3差異結(jié)合位點(diǎn)的靶基因分析

3.4.4差異位點(diǎn)靶基因的GO功能富集分析

3.4.5差異位點(diǎn)靶基因的KEGG富集分析

3.5ATAC-SEQ與RNA-SEQ數(shù)據(jù)聯(lián)合分析結(jié)果

3.5.1ATAC-SEQ靶基因與RNA-SEQ差異基因分析

3.5.2OVERLAP基因GO、KEGG富集分析

1、ATAC-seq技術(shù)通常與哪些技術(shù)結(jié)合起來研究？

ATAC-seq獲得的是全基因組處于開放狀態(tài)的序列，這些序列包含了潛在的調(diào)控元件，屬于表觀遺傳學(xué)的范疇，它通常與RNA-seq、ChIP-seq、Hi-C等技術(shù)相結(jié)合，可以深入研究基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

2、ATAC-seq實(shí)驗(yàn)樣本要求？

ATAC-seq實(shí)驗(yàn)的起始細(xì)胞量與轉(zhuǎn)座酶的用量需匹配（5萬個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)50ul酶切體系），樣本量要求：

細(xì)胞系：每管5萬個(gè)細(xì)胞，平行準(zhǔn)備3管以上；  

動(dòng)物組織：每管0.1g，平行準(zhǔn)備3管以上；

3、ATAC-seq需要生物學(xué)重復(fù)嗎？測(cè)多少數(shù)據(jù)量？周期如何？

至少需要做2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，推薦3個(gè)重復(fù)。我們采用PE150測(cè)序策略，每個(gè)樣本的測(cè)序量10G。周期為40個(gè)工作日（2個(gè)月）。