|
|
當前位置
項目簡介
染色質是真核生物基因組DNA主要存在形式，對蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用的研究可以闡明真核生物基因表達調控機制。染色質免疫沉淀（Chromatinimmunoprecipitaion, ChIP）是用來研究細胞內特定基因組區域特定位點與結合蛋白相互作用的技術，可用于DNA與多種蛋白的互作研究。 ChIP-Seq是指將ChIP與新一代測序技術相結合，可在全基因組范圍內分析蛋白結合位點。用于在全基因組范圍中研究DNA結合蛋白（相互反應）、組蛋白修飾（表觀遺傳標記）和核小體的技術，研究這三個主題可有助于了解基因之間的相互調控以及染色體的功能結構。 ChIP-Seq實驗原理：在生理狀態下，把細胞內的DNA與蛋白質交聯（Crosslink）后裂解細胞，分離染色體，通過超聲或酶處理將染色質隨機切割，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來，再通過反交聯（Reversecrosslink）釋放結合蛋白的DNA片段，最后測序獲得DNA片段的序列。
ChIP-seq實驗原理 ChIP-Seq研究應用：轉錄因子結合位點（transcription factor binding sites，TFBS）、組蛋白修飾（histone modification），并且可以對多個樣品進行差異比較。組蛋白方面，研究人員可通過ChIP-Seq探究組蛋白的甲基化、乙酰化、泛素化修飾對其結合DNA的影響。在轉錄因子方面，可通過分析轉錄因子結合序列的特征發現其經典作用基序或協同作用因子，也可通過分析這些轉錄因子在基因組上的位置分布情況來拓展其基因調控作用。轉錄因子通常分布在基因啟動子區和增強子區，通過ChIP-Seq檢測特定轉錄因子分布情況，可能發現新的靶基因或調控機制。此外，通過比較轉錄因子在不同階段或不同狀態的樣本中靶點的差異，還可分析該轉錄因子的作用差異。 ChIP-seq提供了一種高分辨率、低噪音、高覆蓋率的研究蛋白質-DNA互作手段，可應用到所有基因組序列已知的物種，可研究任何一種DNA相關蛋白與其靶定DNA之間的相互作用，并能確切得到每一個片段的序列信息。而ChIP-seq與HiC、ATAC-seq、RNA-seq的聯合研究可以對基因轉錄調控作用進行詳盡的分析。ChIP-seq正逐步成為研究基因調控和表觀遺傳機制的熱點手段，具有很好的應用前景。
ChIP-seq與其他技術的區別 ChIP-Seq的優勢： 1、具有堿基層面的分辨率； 2、不會有ChIP-chip中由DNA片段雜交導致的噪音； 3、ChIP-chip中的微陣列信號不是線性增長的，其所測量的范圍有限。 4、由于在設計array時，探針的數量、種類有限，當coverage比較高的時候無法準確測量，也無法發現新的序列。 參考文獻： 1.Zhang X L, Wu J, Wang J, et al. Integrative epigenomic analysis reveals unique epigenetic signatures involved in unipotency of mouse female germline stem cells[J]. Genome Biology, 2016, 17(1): 1. 2.EglN2 associates with the NRF1‐PGC1α complex and controls mitochondrial function in breast cancer. (EMBO J, 2016) 3.Conditional Knockin of Dnmt3a R878H inituates acute myeloid leukemia with mTOR pathway involvement (PNAS, 2018) 4.FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 activates SEPALLATA2 but inhibits CLAVATA3 to regulate meristem determinacy and maintenance in Arabidopsis. (PNAs, 2016) 5.H2A monoubiquitination in Arabidopsis thaliana is generally independent of LHP1 and PRC2 activity. (Genome Biology, 2017) 6.SETDB1 modulates PRC2 activity at developmental genes independently of H3K9 trimethylation in mouse ES cells (Genome research, 2015，IF=11.3) 技術流程
技術流程
項目周期
樣本要求
1、樣本要求 1.1 新鮮細胞樣品 a.Histone ChIP細胞量>20million，TF ChIP細胞量>100million b.客戶樣品、抗體、樣品的完整信息單 c.新鮮細胞需要我公司進行細胞固定，請務必于送樣前一天通知實驗人員，準備時間進行細胞處理 1.2 已固定細胞 a.用于ChIP實驗的細胞Histone細胞量每份>10million，TF細胞量每份>50million b.與ChIP-seq實驗同一批次培養的未固定細胞沉淀2million（管內不應要有液體殘留） c.客戶樣品、抗體、樣品的完整信息單 1.3 組織樣品 b.建議取材后用生理鹽水進行漂洗，以去除血漬和污物，并剔除結締組織等非研究組織。 c.將樣品分割成100 mg左右的小塊，樣品分割和處理時應在冰上進行，防止樣品降解。 d.為確保實驗的順利，建議樣品備份1-2份，以防備部分樣品降解重新取材、制備或送樣，耽誤時間。 e.客戶樣品、抗體、樣品的完整信息單。 f.若需要長途運輸，請將組織樣品液氮速凍，干冰運輸。 2、樣本運輸 2.1樣品包裝
2.2 樣本標識 在容器表面寫清樣品名稱，且與信息單上一致。不建議用油性筆直接在管壁或管蓋上寫樣品名稱等信息，**將樣品名稱等各種信息寫在標簽紙上，貼在管壁，外面再用透明膠帶纏繞一圈(防止標簽紙沒有粘牢脫落，導致樣品無法應用)。 2.3 樣本運輸條件 1、運輸過程中需要添加的干冰和冰袋的量與季節、運輸時間長短、泡沫盒的薄厚有關(為更有利于保溫，盡量選用大塊的干冰，建議將樣品用透明膠固定于冰袋上，防止干冰揮發導致樣品降解)。 2、所有樣品盡量保證48小時內運達。 3、銷售請于寄送前告知實驗室人員和科研助理，所有樣品不支持到付。 結題報告
1 項目信息 1.1 基本思想 1.2 實驗流程 1.3 信息分析流程 1.4 樣品說明 2 數據過濾及比對 2.1 原始數據 2.2 數據過濾 2.3 數據質量值分布 2.4 數據堿基分布
R e a d s堿基比例分布圖 2.5 比對分析 2.6 比對質量
比對質量統計 2.7 相關性分析
樣品間相關性檢查 2.8 R ea d s分布
全基因組上R e a d s分布圖 2.8.1 覆蓋度 2.8.2 在染色體分布 2.8.3 在Repea ts區域分布 2.8.4 在功能元件分布 3 P ea k s識別 3.1 F r a g_ si ze預測
F r a g _ si z e分布圖 3.2 覆蓋度
P e a k s覆蓋深度分布圖 3.3 長度分布
P e a k s長度的密度分布圖 3.4 在染色體分布
染色體上P e a k s的分布圖 3.5 在功能元件分布
基因組不同區域上的P e a k s分布圖 3.6 顯著程度分布
P e a k s顯著程度分布圖 3.7 富集倍數分布 3.8 峰頂個數 4 R ea d s分布 4 .1 TSS上下游 4 .2 TE S上下游 4 .3 峰頂上下游R ea d s分布 5 差異分析 5.1 P ea k s區域R ea d s富集分析
不同樣本P e a k的相關性層次聚類圖
不同樣本間的相關性熱圖
樣本富集程度分布圖
不同樣本P e a k的相關性層次聚類圖
不同樣本間的相關性熱圖
樣本富集程度分布圖 5.2 P ea k s富集倍數分析
富集程度差異分布圖 5.3 P ea k s差異分析 5.4 差異相關基因分析
兩個樣品中P e a k s相關基因V e nn圖 6 富集分析 6 .1 G O 富集分析
P e a k s相關基因的W e g o圖 6.1.1 GO 統計 6.1.2 GO 富集DAG圖 6.1.3 顯著功能富集分析 6 .2 K E G G 富集分析 6.2.1 KEGG通路分析 6.2.2 顯著功能富集分析
P e a k s相關基因的K E G G富集散點圖 6.2.3 富集通路圖
K E G G生物學通路圖 7 參考文獻 8 幫助說明 8 .1 IG V 使用說明 FAQ
1、ChIP-Seq的主要研究領域有哪些？ （1）判斷DNA鏈的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾； （2）檢測RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結合位點的精確定位； （3）研究組蛋白共價修飾與基因表達的關系； （4）CTCF轉錄因子研究。 2、哪些因素會影響 ChIP-Seq 的結果？ 抗體的質量與特異性、實驗設計、ChIP 的實驗操作、DNA 片段長度范圍、測序深度、測序質量等都會影響ChIP-Seq 的結果。 3、樣品制備過程中是否需要 PCR 擴增？PCR 擴增后是否會影響最后的結果？ 由于 ChIP 下來的 DNA 樣品量通常非常少，所以在樣品制備過程中需要經過一步 PCR 擴增，主要是為了獲得足夠上機反應的 DNA 量。如果提供的 DNA 樣品足量，可減少 PCR 循環數或不進行 PCR 擴增。PCR 擴增有可能增加結果的偏向性。 4、哪些物種可以做ChIP-Seq？ 物種為2倍體，基因拼接至染色體水平（NCBI），注釋完整（GTF文件）即可。 5、Input和IP樣本之間的關系是什么？ Input和IP屬于兩個樣本，在前期檢測、建庫、測序都是平行進行的，但是分析中需要將兩個樣本的測序數據進行整合分析，得出最終的peak結果，并進行后續分析。 6、Input是什么？有什么作用？ 我們將DNA或者RNA片段化后，在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質做Input對照（不進行免疫沉淀過程）。Input是斷裂后的基因組DNA或者RNA，需要與沉淀后的樣品DNA/RNA一起經過逆轉交聯，DNA/RNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測。通過后續數據分析，我們可以通過Input對照排除背景噪音（排除因本底表達水平高或一些非特異性結合所造成的假陽性peaks），驗證染色質斷裂的效果和整個實驗中IP效果，所以Input對照是IP-seq實驗必不可少的步驟。 7、陽性對照和陰性對照是什么？ 陽性對照 一般用anti-RNA polymerase II抗體，因為RNA polymeraseII是通用轉錄因子，在所有細胞中都能結合基因的核心啟動子區，因此理論上，ChIP后PCR會有條帶。一般陽性對照不進行測序。 陰性對照 陰性對照分為mock和Input兩種，二者均能起到減少假陽性的作用。mock：用普通IgG為抗體，理論上不會ChIP下來任何DNA片段，因此作為陰性對照，但是由于非特異性結合，或者實驗過程，沒發生結合的DNA清楚不完全，可能會出現條帶，但是一般條帶亮度較弱。IgG不需要進行測序，只是判斷IP試驗中所選取的抗體是否特異。 8、起始細胞的量 起始細胞量在5*10e6以上，如果細胞量太少，ChIP富集得到的量很少，不一定能滿足后續的實驗要求。細胞量也不宜過多，細胞量太多會影響染色質打斷的效果。我們推薦超聲破碎時細胞密度不要高于1*10e7/mL。也可以通過超聲破碎之后chromatin的量來定量。一般做組蛋白和組蛋白修飾的ChIP，chromatin量在7-10ug；對于結合位點比較多的轉錄因子，chromatin的量在15-20ug；對于結合位點很少的轉錄因子和蛋白，推薦使用20-30ugchromatin 進行IP實驗。 9、甲醛交聯應該注意什么 甲醛對人體有害，操作**在通風廚中進行。甲醛交聯的終濃度為1%，時間一般為10-15min。交聯的時間過長會影響超聲破碎的效果。一般培養細胞交聯10min，組織樣品交聯15min。交聯之后立即用終濃度125mM的甘氨酸中和甲醛，終止交聯。交聯時間延長會影響染色質打斷的效果，也會增加蛋白和DNA非特異性的結合。 10、ChIP 超聲波打斷的效果 不同的細胞和組織，超聲破碎的條件不太一樣，如果處理的細胞之前沒有做過ChIP實驗，不知道超聲條件的，在正式實驗之前，需要摸索超聲破碎的條件。超聲破碎處理時間不宜過長，時間過長會影響蛋白和DNA的結合，也可能會破壞蛋白的結構，影響ChIP實驗富集的效果。超聲打斷時間太短會導致染色質片段偏大，PCR擴增過程中引入背景信號。 11、ChIP 實驗對抗體的要求 ChIP 實驗對抗體要求很高，需要抗體的特異性和親和性都很強。如果抗體的特異性不好，最終IP富集到很多非特異性的DNA序列。如果抗體的親和性不好，最終富集到的DNA量會很少。由于ChIP實驗過程中會使用甲醛交聯處理，會導致蛋白的結構發生變化，普通能做WB和IP的抗體，不一定能滿足ChIP的實驗要求。在正式的ChIP實驗之前，**提前驗證抗體是否滿足ChIP或者IP級別。 12、ChIP 實驗抗體的使用量 抗體的量可以根據超聲破碎之后chromatin的量來確定。我們推薦10ug的chromatin加入3-5ug的ChIP級別抗體。抗體量太少最終富集的DNA濃度偏低，抗體過多會增加背景。 13、ChIP 實驗引物的設計 ChIP實驗結果的檢測需要設計陰性和陽性引物進行PCR擴增。ChIP引物的設計非常關鍵。如果引物設計有問題，很可能導致ChIP實驗成功了，但是檢測結果是假陰性的，也可能發生ChIP 實驗失敗了，但是檢測結果是假陽性的。 14、靶基因的選擇 ChIP 靶基因的選擇可以參考已經發表的文章，另外像ENCODE和roadmap等項目已經做過很多組蛋白修飾和轉錄因子的ChIP-Seq實驗，也可以從這些已經發表的數據中查找目的蛋白結合區域和靶基因。 15、ChIP-Seq對抗體要求有多高？ 要做好ChIP-Seq，滿足要求的抗體是至關重要的，一般客戶選擇文獻中報道的抗體來做實驗，但是抗體有運輸和批次間差異問題，所以很多時候買到的抗體大部分是不滿足該實驗要求的，ABclonal整合了全球的ChIP-Seq抗體資源，每種抗體都大包裝備有庫存，來解決客戶遇到的最棘手的問題。 16、做好ChIP-Seq實驗關鍵技術點有哪些？ 染色質的打斷和高特異性的抗體是ChIP-Seq實驗的關鍵。ChIP-Seq對DNA片段的要求一般為200-800bp，DNA的打斷可以通過酶切或者超聲破碎的方法。對于不同用量的細胞或者組織樣品，通常需要摸索最適的酶切或者超聲破碎條件。抗體主要依賴其高親和力和高特異性，且商業化抗體選擇有非常多的經驗講究。 17、能夠做ChIP-Seq的靶點主要是哪些領域的蛋白？ 主要集中在組蛋白修飾位點、表觀遺傳因子和轉錄因子等能夠和DNA結合的靶點蛋白。 18、ChIP-Seq需要樣本量以及樣本運輸等問題？ 交聯細胞（優先）：3X107，需甲醛、甘氨酸等處理，保留細胞沉淀，干冰運輸。 19、ChIP-Seq測序數據一般需要多大？ 不同DNA結合蛋白或者組蛋白修飾在基因組上的分布差異很大，因此通過ChIP-Seq對這些DNA結合蛋白或者組蛋白修飾進行研究對測序數據量的要求也有很大的差異。轉錄因子等反式作用因子的測序數據量要求10-20Mreads數目，組蛋白修飾測序數據量要求20-40Mreads數目。 20、ChIP-Seq結果數據分析注意事項以及ABclonal個性化數據分析特點 ABclonalChIP-Seq數據分析包括基本分析和個性化分析。基本分析包括測序數據的質量控制，測序數據比對到基因組上，ChIP-Seq數據在全基因上的不同區域分布趨勢，ChIP-Seq富集peaks的查找，ChIP-Seq peaks區域目的基因的GO功能注釋和pathway分析，查找轉錄因子或者反式作用因子結合的motif。個性化分析我們可以和客戶協商，針對不同的研究內容調整分析策略。針對于不同轉錄因子或者組蛋白修飾在基因組上分布的差異，我們在分析過程中會采取不同的分析策略。 21、ChIP-Seq對照組的概述 由于ChIP-Seq實驗操作過程中涉及到DNA的打斷和抗體富集等諸多因素的影響，對照組的選擇是至關重要的。ChIP-Seq對照的選擇有三種：Input，陽性對照和陰性對照。Input是ChIP實驗過程中打斷的DNA片段，是不通過抗體富集，直接逆交聯再純化得到DNA。Input對照可以用于檢測DNA打斷的效果，以及作為背景信號用于后期的ChIP-Seq數據分析，找到目的蛋白在基因組上富集的區域。陽性對照通常選擇與已知序列相結合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性對照通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。 22、ChIP-Seq數據對提高文章水平的重要性 ChIP-Seq技術是在全基因組范圍上研究DNA結合蛋白和組蛋白修飾以及核小體的分布情況。相對于ChIP和ChIP-ChIP技術來說，ChIP-Seq靈敏度和分辨率都有很大的提高，而背景相對較低。ChIP-Seq數據可以提供給研究人員大量的信息，目前表觀遺傳學領域的高水平文章基本都會用到ChIP-Seq的數據。 23、ChIP-Seq能做哪些樣本和指標？ 根據客戶實驗物種和研究指標，將實驗難度分為四個等級： |
