焦磷酸測序（Pyrosequencing）技術服務基于QIAGEN公司的PyroMark Q96 ID平臺，能提供基于序列測定的SNP檢測、等位基因頻率分析和甲基化檢測，雜合子缺失及細菌和病毒分型等技術服務。

焦磷酸測序（Pyrosequencing）技術的原理:

首先通過PCR制備待測序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素標記的。PCR產物和偶連avidin的Sepharose微珠孵育，DNA雙鏈經堿變性分開；純化得到含生物素標記引物的待測序單鏈，并和測序引物結合成雜交體。 Pyrosequencing技術是由四種酶催化的同一反應體系中的酶級連反應，四種酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase).反應底物為adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、熒光素(luciferin)。反應體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。反應體系配置好后就可以加入底物dNTP進行序列分析了。 測序反應是這樣進行的：在每一輪測序反應中，只能加入四種dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一，如該dNTP與模扳配對，聚合酶就可以催化該dNTP摻入到引物鏈中并釋放焦磷酸基團（PPi）。摻入的 dNTP和釋放的焦磷酸是等摩爾數目的.注意：反應時deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物，因為DNA聚合酶對dATP S的催化效率比對dATP的催化效率高，且dATP S不是熒光素酶的底物。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩爾數目是一致的。ATP驅動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素(oxyluciferin)的轉化，氧化熒光素發出與ATP量成正比的可見光信號。光信號由CCD攝像機檢測并由pyrogram?反應為峰。每個峰的高度(光信號)與反應中摻入的核苷酸數目成正比。ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應體系。然后就可以加入下一種dNTP。 隨著以上過程的循環進行，互補DNA鏈合成，DNA序列由Pyrogram的信號峰確定。

項目流程：

樣品要求

· 樣品類型

細胞、新鮮組織或DNA樣品

· 樣品量

細胞樣品請提供至少1×10⁶個細胞，組織樣品請提供至少100mg的組織塊或切片，DNA樣品請提供1 μg以上的DNA

· 樣品質量

基因組DNA無明顯降解，主帶清晰，大于23Kb，無明顯彌散。OD260/280值在1.8～2.0之間，濃度 ≥ 50ng/μl

· 樣品保存

細胞樣品或新鮮組織塊（切成～50mg的小塊）可液氮凍存后，-80℃保存。DNA樣品可溶于乙醇或超純水中，-80℃保存。樣品保存期間避免反復凍融

· 樣品運輸

樣品置于1.5 ml凍存管中，封口膜封好，干冰運輸

系統用途：

多用途遺傳分析系統，可應用于各種遺傳多態性標記的分析檢測，如SNP、突變、插入/缺失、甲基化、基因拷貝數等；等位頻率分析；此外，還可應用于各種微生物的鑒定、分型、耐藥性評估，并可對多種亞型或野生株及突變株、耐藥株組成的復雜群體中的各個組分含量直接加以定量評估。

服務項目：

1.SNP分型檢測

優勢：

• ◇ 單一位點的質量評估和序列信息

• ◇ 分析含有CpG位點的SNP

• ◇ 序列信息中不同位點的頻率計算

• ◇ 適用于新鮮冷凍，和石蠟包埋的樣本

• ◇ 不同的應用實驗可同時在一次運行中實現

• ◇ PCR反應之后，1個小時內可同時平行分析96個樣本

2.甲基化檢測服務

基本流程 在表觀遺傳學的DNA甲基化研究中，新一代的測序方法可得到大量的全基因組甲基化特征數據，需要驗證其中特定靶序列與表觀遺傳修飾的生理相關性。此驗證過程較具挑戰性，因為甲基化位點的位置和頻率的微小改變也會帶來明顯的變化。焦磷酸測序可在一次檢測中快速定量一個或多個甲基化位點，是理想的驗證方法。因此該技術在表觀遺傳學研究中逐漸成為數據分析的金標準。 設計甲基化分析反應體系往往十分復雜，因為在非CpG位點胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶會影響引物的結合。為了解決這個問題，QIAGEN最近研發出了針對特定基因的預設計PyroMark CpG Assays，可覆蓋整個人類基因組。這些試劑盒可用于CpG甲基化分析，并擴展了靶序列和CpG島的選擇范圍。

優勢：

• ◇ Pyrosequencing 能測定鄰近CpG區域的單個甲基化水平，甚至包括測序的引物區域

• ◇ 啟動子序列中接近的不同CpG島的甲基化頻率計算

• ◇ 適用于新鮮冷凍，和石蠟包埋的樣本

• ◇ 不同的應用實驗可同時在一次運行中實現

• ◇ PCR反應之后，1個小時內可同時平行分析96個樣本

檢測原理

引物設計

結果展示

1 材料

1.1試劑與試劑盒

1.2儀器

2方法

2.1DNA抽提

2.1甲基化修飾

2.2 純化亞硫酸鹽修飾的DNA

2.3 甲基化PCR

2.4 Pyrosequencing檢測