1 動物組織樣本

快速從活體中獲取目的組織后，用預(yù)冷的 1×PBS 或生理鹽水清洗去除血漬和污物，吸干表面液體，并快速將樣品分割成 50～100mg 左右的小塊液氮速凍（除了保證 RNA 質(zhì)量外，還要杜絕因環(huán)境的改變而導(dǎo)致的表達(dá)調(diào)控的變化），放入液氮預(yù)冷的 RNase-free 的帶螺紋旋蓋的凍存管中，-80℃低溫保存、干冰運輸。組織樣品離開活體后，建議在 3min 內(nèi)進行液氮速凍，速凍前操作時間越長，RNA 降解的可能性越大。

如果使用 RNAlater?一類商業(yè)組織 RNA 保護試劑保存組織樣品，請嚴(yán)格按照相應(yīng)產(chǎn)品使用說明進行操作。盡量使組織塊尺寸保持在 5mm 左右，過小或過大都不利于后續(xù)實驗操作。

如果使用 TRIzol 裂解液保存送樣，請務(wù)必先進行液氮研磨破碎，然后加入 TRIzol 中徹底研磨，小于 100mg 組織可加入 1mL TRIzol 裂解。組織樣品切勿過量，常溫裂解 5min 后，-80℃低溫保存，干冰運輸。

2 細(xì)胞樣本

2.1 貼壁細(xì)胞

首先去除細(xì)胞培養(yǎng)上液，然后用 1×PBS 漂洗 1~2 次，徹底去除 PBS 溶液；用足量的 TRIzol 對細(xì)胞進行裂解（一般 10cm2的培養(yǎng)皿均勻鋪滿細(xì)胞需要 1mL TRIzol），裂解過程中用移液器輕輕反復(fù)吹吸，如發(fā)現(xiàn)裂解液有明顯粘絲現(xiàn)象，表示裂解不是很充分，可以適當(dāng)增加裂解液的用量，最終應(yīng)為裂解液澄清，沒有細(xì)胞碎片團塊。然后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 的 EP 管中，室溫靜置繼續(xù)裂解 5min 后，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱長期保存。參考用量為每 5×106個細(xì)胞加 1mL TRIzol。備注：貼壁細(xì)胞切勿使用胰酶消化后收集，以防樣本出現(xiàn)降解。

2.2 懸浮細(xì)胞

離心收集細(xì)胞，然后用 1×PBS 漂洗 1~2 次，徹底去除 PBS 溶液。注意細(xì)胞離心收集速度要適度，一般樣本 3,000rpm 離心 5min 即可。不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，轉(zhuǎn)數(shù)過高還會導(dǎo)致細(xì)胞破裂，RNA 降解。再用充足量 TRIzol 對細(xì)胞進行裂解（方法同 2.3.1 貼壁細(xì)胞處理）。裂解在 TRIzol 中的樣品，短期保存于-20℃冰箱中（1 周內(nèi)），如長期保存可轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱。參考用量為每 1×106個細(xì)胞加 1mL TRIzol。也可離心收集細(xì)胞后直接液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃低溫長期保存，干冰運輸。

2.3 血液樣本

用于提取Total RNA的血液，強烈建議使用血液保護劑送樣或分離白細(xì)胞后送樣。常規(guī)的EDTA抗凝管收集的全血不太適合用于RNA的研究。推薦使用 BD PAXgene blood tube 保存。PAXgene?血液RNA管內(nèi)含穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的添加劑，它是通過減少體外RNA降解并將基因誘導(dǎo)減少到最小而發(fā)揮作用的。操作流程如下：

2.3.1 PAXgene 血液采集

PAXgene 系統(tǒng)提供標(biāo)準(zhǔn)化的 BD Vacutainer（真空采血管，室溫保存），配合使用一次性消毒采血針作靜脈穿刺，采血管內(nèi)的負(fù)壓會迫使血液自動吸入管中，當(dāng)搜集的血液達(dá)到 2.5 毫升刻度線時停止采血。采血管中本身已經(jīng)預(yù)裝了 6.9 毫升的 RNA 穩(wěn)定試劑，拔出針頭后只要將采血管輕輕顛倒 8-10 次將二者混勻即可。如圖 1 所示：

圖 1 PAXgene 采血示意圖

將 PAXgene?血液 RNA 管豎直置于室溫（18°C 到 25°C）下平衡，最短 2 小時，最長 72 小時，之后轉(zhuǎn)移至 4°C 過夜，最后置于-80°C 保存，干冰運輸。

2.3.2 哺乳動物白細(xì)胞的分離方法

使用 EDTA 抗凝管收集的全血樣本應(yīng)立即加入 3 倍體積紅細(xì)胞裂解液，室溫放置 5min，期間顛倒混勻數(shù)次。1,500g，離心 5min，棄上清。再加入 1mL 紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，1,500g，離心 5min，TRIzol 裂解（一般起始量 2mL 全血的沉淀，加 1mL TRIzol）。用移液器反復(fù)吹打至看不到細(xì)胞團塊，溶液呈澄清而不粘稠的狀態(tài)。放入-80℃冰箱中長期保存，干冰運輸。

2.4 血漿樣本

取出血液樣本，1,600g，4℃離心 10min。離心后血液分為三層，上層的是血漿，中間的是白細(xì)胞層，下層的是紅細(xì)胞層，用移液器吸取血漿至凍存管中。在分離血漿時取至白細(xì)胞層以上 3-4mm 處為宜。血漿中含有游離核酸，為去除殘余細(xì)胞中核酸對游離核酸的干擾，應(yīng)將血漿進行二次離心。將血漿在 4℃條件下以 16,000g 離心 10 分鐘。血漿根據(jù)后續(xù)的實驗要求進行分裝，每管樣本量為單次實驗所需的量為宜，如 300-500μL/管。-80℃冰箱保存，干冰運輸。

注意事項：

a) 推薦 EDTA 抗凝處理，盡量避免肝素抗凝血，已有研究報道認(rèn)為高濃度肝素對后續(xù)酶學(xué)反應(yīng)有抑制作用，可能會造成檢測失敗。

b)分離血漿的過程盡量在冰上操作，以維持血細(xì)胞的完整性。

c)整個分離操作應(yīng)在 4 小時內(nèi)完成。

2.5 血清樣本

血清，指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白原分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋原白已被除去的血漿。為使血液完全凝固，將收集管室溫（15-25℃）靜置 10min 至 1h。若收集管中有促凝血劑，則凝血時間為 10min。若未加促凝血劑，凝血時間至少為 30min。1,600g，4℃離心10min。小心轉(zhuǎn)移上層血清層至新的離心管。16,000g，4℃離心 10min。小心轉(zhuǎn)移澄清的上清液，凍存于-80℃冰箱備用，干冰運輸。

2.6 石蠟包埋樣本

至少提供 10 片以上 10μm 厚度的切片或者提供包埋的蠟塊。切取石蠟時，如果標(biāo)本暴露空氣中，棄去最初的 2-3 片，切片完成后盡量選取切片中組織含量高的部分，如果石蠟過多可切去石蠟部分。如果需要再從切片上剝離特定區(qū)域的組織（如腫瘤），除了提供白片之外，還需要提供 HE 染色的片子，并在 HE 片子上圈出特定區(qū)域。

2.7 RNA

客戶需提供 NanoDrop?、 Qubit? 或 Agilent 2100? 的樣本分析結(jié)果：請仔細(xì)純化樣品，盡量避免多糖、蛋白質(zhì)和外切酶的殘留，樣本必需注明溶劑成分。