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Ribo-seq核糖體印跡測序技術

? 項目簡介

Ribo-seq (Ribosome profiling)，即核糖體印跡測序技術，系由 Weissman 課題組于 2009 年首次發表的翻譯組學研究技術[1]。利用 Ribo-seq，研究者能從基因組水平檢測蛋白質的翻譯狀況，獲得全面的、高質量的蛋白質翻譯速度情況，了解蛋白質表達情況及其豐度，還能直接對翻譯過程進行研究。

? 技術原理

利用核酸酶降解沒有核糖體覆蓋的 mRNA 片段，高通量測序獲得 ribosome footprints，及核糖體分布的位置信息。而 footprints 密度越高的位點，表明翻譯延長速率越慢。

Ribo-seq 技術流程[2]

Ribo-seq 檢測翻譯延長速率的原理[2]

? 技術應用

聯合 longRNA-seq，研究轉錄本上正在進行的翻譯情況，深入了解基因調控最重要層面：

1. 了解轉錄本上的核糖體分布、翻譯活性

2. 推測翻譯起始位點、ORF 位置

3. 確定蛋白翻譯效率

4. 探究翻譯調控和基因表達情況

5. 鑒定新蛋白 / 新短肽

? 送樣要求

樣本類型：

1. 細胞，≥ 1×107 個細胞 / 樣本

2. 組織，≥ 50mg/ 樣本

樣本物種：**人、大小鼠，其他物種需評估

? 樣品分組

1. 常規要求至少 2 組樣品，包括對照組和實驗組（臨床樣本為正常人組和患者組）

2. 每個樣品均進行 Ribo-seq 和 longRNA-seq

3. 樣本數建議：3 VS 3

? 分析內容

Ribo-seq 組基本分析

1. 全基因組翻譯活性分析

2. 基因翻譯效率計算

3. 差異翻譯效率基因分析

4. 差異翻譯效率基因 GO 分析

5. 差異翻譯效率基因 KEGG 分析

6. 起始密碼子預測（包括非 ATG 起始）

7. ORF（開放閱讀框）位置預測

8. 新蛋白 / 新短肽鑒定

9. 密碼子使用頻率差異分析

10. lncRNA / circRNA 編碼能力預測

對照 longRNA-seq 分析

1. 數據質控

2. 基因比對與統計

3. mRNA 差異表達分析

4. lncRNA 差異表達分析

5. 差異基因 GO 分析

6. 差異基因 KEGG 分析

7. circRNA 差異表達分析

? 實測數據

圖 1. Ribo-seq 比對到基因組的 read 的長度分布情況

圖 2. P-site 信號在 5'UTR、CDS、3'UTR 區間的分布

圖 3. Ribo-seq 呈現典型的周期性 3-nt 分布

圖 4. 不同密碼子使用頻率分析

? 客戶文章

Cancer Cell：m6A甲基化“閱讀器”IGF2BP2塑造AML谷氨酰胺代謝依賴性展[3]

此研究發現IGF2BP2作為m6A的閱讀器通過調控下游基因GPT2、SLC1A5和MYC的mRNA穩定性和翻譯從而促進急性髓性白血病（AML）的谷氨酰胺代謝過程，在AML的發生、發展、維持及干性中發揮了重要作用，并進一步開發以IGF2BP2為藥物靶點的小分子抑制劑（CWI1-2），為AML的治療提供新的靶點和策略。

圖5. 利用Ribo-seq發現IGF2BP2敲減導致全局翻譯效率下降

Blood：circMYBL2 通過募集 PTBP1 調控 FLT3 翻譯，促進 FLT3-ITD 型急性髓系白血病進展[4]

此研究發現 circMYBL2 在 FLT3-ITD 突變型 AML 患者中的表達水平更高；在體外和體內實驗中，敲降 circMYBL2 可抑制 FLT3-ITD AML 細胞的增殖，并促進其分化。在機制上，circMYBL2 可通過增加 PTBP1 與 FLT3 mRNA 的結合，提高FLT3 激酶的翻譯效率。敲降 circMYBL2 可破壞對抑制劑耐藥的 FLT3- ITD 陽性細胞的細胞活性，顯著降低 FLT3 激酶的表達水平，進而使下游通路失活。本研究提示 circMYBL2 或可成為 FLT3-ITD AML 的潛在治療靶點。

圖6. D. Ribo-seq 結果顯示，circMYBL2 敲降后，MOLM-13 細胞基因的核糖體占位（翻譯效率）發生變化；E. 敲降 circMYBL2 后，Ribo-seq 顯示 FLT3 mRNA 的翻譯效率下降。

? 參考文獻

[1] Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, et al. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleo- tideresolution using ribosome profiling. Science, 2009, 324(5924): 218-223

[2] Gobet C, Naef F. Ribosome profiling and dynamic regulation of translation in mammals. Curr Opin Genet Dev. 2017Apr;43:120-127.

[3] Weng H, Huang F, Yu Z,et al. The mA reader IGF2BP2 regulates glutamine metabolism and represents a therapeutic target in acute myeloid leukemia.Cancer Cell 2022 Oct 26 （客戶文章）

[4] Sun YM, Wang WT, Zeng ZC, et al. circMYBL2, a circRNA from MYBL2, regulates FLT3 translation by recruiting PTBP1to promote FLT3-ITD AML progression. Blood. 2019 Oct 31;134(18):1533-1546.]（客戶文章）

[5] ChenH, Gao S, Liu W,et al. RNA N-Methyladenosine Methyltransferase METTL3 Facilitates Colorectal Cancer by Activating the mA-GLUT1-mTORC1 Axis and Is a Therapeutic Target. Gastroenterology 2021 03;160(4). （客戶文章）

[6] Wei R, Cui X, Min J, et al. NAT10 promotes cell proliferation by acetylating CEP170 mRNA to enhance translation efficiency in multiple myeloma. Acta Pharm Sin B. 2022 Aug; 12(8): 3313–3325. （客戶文章）