一、   樣本組設(shè)計要求

項目的樣本組設(shè)計、樣本處理條件等對于檢測結(jié)果會有影響，對于發(fā)表文章的科學(xué)意義也至關(guān)重要。

我們參照文章審稿常見的問題，請您對樣本進行以下的核實：

• 樣本凍存之前，已經(jīng)確保離心除去細胞 （細胞冷凍破裂會影響外泌體純度）；

• 樣本保存后，未經(jīng)過反復(fù)凍融，各樣本凍融次數(shù)一致；

• 每個樣本的處理條件一致，無顯著系統(tǒng)誤差：

o   樣本采集后，等待處理的時間、保存溫度、運輸方式和距離一致；

o   樣本處理步驟一致：如離心時間、溫度和速度；盡量是同樣的實驗員；

o   血漿：抗凝方法一致；

o   血清：制備條件參數(shù)較多，請確保完全一致；

• 樣本包括了適當(dāng)?shù)膶φ战M；

• 樣本組和對照組的處理條件一致性；

• 樣本組和對照組的入組和排除標(biāo)準(zhǔn)：

o   樣本組和對照組：年齡、性別、地域分布一致；

o   更嚴(yán)格地，樣本組和對照組飲食習(xí)慣、BMI、飲酒、吸煙等習(xí)慣分布一致；

o   其他重要疾病的存在情況是否一致。

二、   樣本類型、送樣體積、建議的處理條件

1. 血漿或血清

·        由送樣單位采集血液，分離血漿或血清后-80度冷凍，干冰箱寄送；

·        樣本類型：

可檢測血漿或血清樣本；同一項目中制備方式保持一致。

血漿制備可以采用任何一種抗凝管

·        檢測用量：

o   如需要超離提取，樣本建議為每例3 ml；

o   如需SEC或超濾法提取，樣本需求為每例0.5 ml；

o   如選擇體液直接捕獲，樣本需求為每例0.1 ml；（支持96孔板送樣，建議使用0.2ml孔板，以耐-80度低溫鋁膜貼緊，每孔樣本體積0.1 ml。）

·        血漿分離步驟：

1.   取血樣，置于4度冷藏或冰上, 60分鐘內(nèi)按以下2步離心處理；

2.   **步離心制備血漿：低速離心， 離心15分鐘，2000 g，取上層血漿，切勿吸出白膜層及紅細胞沉淀。若出現(xiàn)溶血，應(yīng)棄用；

3.   第二步離心去除其他沉淀：低速離心， 離心15分鐘，10000 g，去除沉淀，取上清液；

4.   取上層清液于新的離心管中 (最多裝至管的三分之二體積，以防冷凍后溢出)

5.   標(biāo)記：送樣管上有清晰標(biāo)記，送樣單上記錄對應(yīng)信息。

6.   于-80度保存。

·        血清分離步驟：

1.   按照實驗室SOP促凝血并離心制備血清；若出現(xiàn)溶血，應(yīng)棄用；

2.   第二步離心去除其他沉淀：低速離心， 離心15分鐘，10000 g，去除沉淀，取上清液；

3.   取上層清液于新的離心管中 (最多裝至管的三分之二體積，以防冷凍后溢出)

4.   標(biāo)記：送樣管上有清晰標(biāo)記，送樣單上記錄對應(yīng)信息。

5.   于-80度保存。

2. 其他體液（尿液、腦脊液、骨髓液、體內(nèi)積液、唾液、痰液、淚液）

·        檢測用量：

o   若需要外泌體提取，樣本需求為每例尿樣 > 10 ml，唾液> 3 ml，腦脊液 > 1 ml，骨髓液> 1 ml，體內(nèi)積液 > 3 ml，痰液> 1 ml。

o   若無需提取，樣本需求為體液樣本每例0.5 ml。

·        分離步驟：

1.   取體液，置于合適的離心管中，置于4度冷藏或冰上, 60分鐘內(nèi)按以下2步離心處理。若體液粘稠，如痰液、唾液，請加入PBS稀釋后進行離心去除細胞。

2.   **步離心：低速離心， 離心15分鐘，2000 g，取上清液，若血液混入體液，請備注；若血液混入后出現(xiàn)溶血，應(yīng)棄用；

3.   第二步離心：低速離心， 離心15分鐘，10000 g，去除沉淀，取上清液；

4.   取上層清液于新的離心管中 (裝至最多三分之二體積)，切勿吸出沉淀。

5.   標(biāo)記：送樣管上有清晰標(biāo)記，送樣單上記錄對應(yīng)信息。

6.   于-80度保存。

3. 細胞培養(yǎng)液等低濃度EV懸液

·        適用樣本：

細胞培養(yǎng)液、關(guān)節(jié)沖洗液、淚液收集、組織消化后上清液等樣本的EV提取產(chǎn)物均可檢測。

·        細胞系培養(yǎng)EV檢測注意事項：

o   請?zhí)峁┣‘?dāng)?shù)膶φ諛颖荆缭摷毎档耐蔚男迈r培養(yǎng)液；

o   盡量使用去外泌體牛血清exosome-depleted FBS (dExo-FBS)培養(yǎng)細胞。

·        分離步驟：

1.   **步離心：低速離心， 離心15分鐘，2000 g，取上清液，沉淀應(yīng)棄用；

2.   第二步離心：低速離心， 離心15分鐘，10000 g，取上清液，沉淀應(yīng)棄用；

3.   取上層清液于新的離心管中 (裝至最多三分之二體積)，切勿吸出沉淀。

4.   標(biāo)記：送樣管上有清晰標(biāo)記，送樣單上記錄對應(yīng)信息。

5.   于-80度保存。

4.已提純的EV樣本

·        適用樣本：

EV提取產(chǎn)物均可檢測。

·        注意事項：

o   外泌體提純產(chǎn)物以PBS重懸；

o   高濃度提純EV，送樣體積大于30μl，粒子濃度大于10¹⁰/ml。

o   SEC產(chǎn)物直接送樣，無需濃縮，對應(yīng)至少50ul血漿或500ul尿液的提取產(chǎn)物

o   送樣管上有清晰標(biāo)記，送樣單上記錄對應(yīng)信息。

o   于-80度保存，且樣本冷凍于底部，無分散液滴。