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small RNA 測序
small RNA（包括 miRNAs、siRNAs 和 piRNAs 等）是生命活動重要的調控因子，在基因表達調控、生物個體發育、代謝紊亂及疾病發生和發展等生理過程中發揮重要作用。miRNA 是一類內源性的、長度約 18-25 nt、具有調控功能的非編碼 RNA，通過和靶基因堿基配對引導沉默復合體降解 mRNA 或阻礙其翻譯。Small RNA 測序技術不受物種限制，既能鑒定特定條件下表達的 miRNA，又能預測發現新的 miRNA，對于疾病的發生發展研究有重要意義。 高度靈活性 可研究任一 17-35 nt 之間的小 RNA 分子 高度準確性 可準確到單核苷酸水平，有利于區分高度同源的小 RNA 分子和鑒定小 RNA 的多態性 檢測動力學范圍廣 可在超過 6 個數量級范圍內實現準確的序列檢測和定量分析，有利于低豐度小 RNA 差異表達的研究 數據質量高 深度測序保證了抽樣隨機性、可靠性和重復性，與實時定量 PCR 結果具有較高的一致性 推薦測序模式 ● Hiseq X Ten, PE150 ● 10 M 或 20 M clean reads/樣本 案例展示 案例一 輪狀病毒編碼的病毒樣 small RNA 通過 PI3K/Akt/mTOR 通路靶向 IGF1R 觸發宿主細胞自噬 研究背景輪狀病毒是雙鏈 RNA 病毒，它是嬰兒病毒性腹瀉的主要原因。病毒可以創造一個微環境，通過編碼 miRNA 等靶向調控各種宿主細胞的分子來促進其生存和自我增殖。然而，RNA 病毒是否編碼 miRNAs 以及其調控機制仍有待于探究。 研究內容 我們攜手中國醫學科學院醫學生物學研究所，發現輪狀病毒（Rotavirus， RV）編碼的 small RNA RV-vsRNA1755 可以通過 PI3K/Akt/mTOR 通路靶向調控 IGF1R 觸發宿主細胞自噬。通過 small RNA 測序分析確定研究對象 RV-vsR-NA1755，發現 RV 感染初期其通過靶向調控 IGF1R 導致 PI3K/Akt/mTOR 通路受到抑制，并觸發了細胞自噬，但最終會抑制自噬體的成熟。
圖 1 | 技術路線
圖 2 | 預測 RV-vsRNA1755 前體序列 研究結果 1. small RNA 測序發現，Chr17_1755 在 RNV 感染后表達量顯著性升高，因此 Chr17_1755 可能是 RV 負責編碼的 small RNA。 2. 通過 mirdeep2 預測 Chr17_1755 前體序列并將 PCR 產物與 RV NSP4 基因組比對，確定 RV-vsRNA1755 (Chr17_1755) 來自于 RV，且由 NSP4 編碼。 3. 通過 miRanda 靶基因預測、熒光素酶報告實驗、qRT-PCR 和 WB 等確定 RV-vsRNA1755 調控 PI3K/Akt 通路中 IGF1R 的表達。 4. 對不同感染階段 Akt 和 mTOR 的磷酸化水平進行檢測發現，在 RV 感染初期，PI3K/Akt/mTOR 通路被抑制，檢測細胞自噬水平發現 RV 感染引起細胞自噬。 5. 過表達 RV-vsRNA1755 和沉默 IGF1R 均發現促進了 LC3II 的形成和 P62 的降解，同時細胞自噬水平升高。 參考文獻 Zhou Y, Geng P, Liu Y, et al. Rotavirus-encoded virus-like small RNA triggers autophagy by targeting IGF1R via the PI3K/Akt/mTOR pathway. BBA-Mol Basis Dis 2018; 1864(1): 60-68. (IF: 5.476) 常見問題 1. small RNA 測序后進行 RT-PCR 驗證時，常會出現非特異性擴增，如何解決？因為 miRNA 序列比較短，彼此間相似度又非常高，尤其是同一家族的 miRNAs，彼此間可能只有 1 個堿基差異，出現非特異性擴增是很正常的，建議使用 Taqman 探針法進行嘗試。 2. 沒有參考基因組可否進行 small RNA 測序？ 進行生物信息分析時，針對有參考基因組樣本，以該物種的基因組以及該物種的 miRBase 數據庫為參照進行數據分析；如果沒有參考基因組，可以近緣物種的基因組以及近緣物種的 miRBase 數據庫為參考，或者動物樣本以所有動物的 miRBase 數據庫、植物樣本以所以植物的 miRBase 數據庫為參照進行比對分析。 3. small RNA 測序對樣本有什么特殊要求？ 為防止 small RNA 丟失，浪費樣本、時間和精力，抽提 total RNA 時請使用 miRNA Homogenate Additive。如果同一份樣本同時檢測 mRNA/lncRNA 和 small RNA，請事先告知該區域負責的銷售工程師，請公司抽提人員注意保留 small RNA。 |
